几种新型α-芋螺多肽的作用靶点及构效关系研究

【摘要】目的以及意义：本研究旨在测定本实验室前期获得的新型α-芋螺多肽对神经元nAChR的作用靶点，并对α-芋螺多肽Vc1.1突变体的构效关系进行研究，为新型α-芋螺多肽进一步的药理学功能研究及应用开发奠定基础。方法：应用Fmoc-固相法在ABI433A合成仪上合成线性多肽，通过氧化折叠、富集（或吸附）、纯化等步骤获得实验所需的α-芋螺多肽。通过提质粒、酶切线性化、纯化、去RNA酶以及体外转录等一系列生物学实验获得实验所需的cRNA。应用双电极电压钳技术，测定α-芋螺多肽对表达在爪蟾卵母细胞上的神经元nAChR各亚型的结合活性。结果：1、合成了5种用于实验的α-芋螺多肽纯品，分别为Mr1.8、Di1.1、Vc1.1[N9R,D11R]、Benzoyl-Vc1.1[N9R]、Vc1.1[D11A]，并测定了新克隆的Di1.1的二硫键连接方式为以“C1-C4，C2-C3”为主。2、获得了电压钳实验所需的神经元型nAChRs亚基(α2、α3、α4、α6α3、α7、α9、α10、β2、β3、β4)质粒、去RNA酶的线性化片段以及cRNA。3、筛选了12种新型α-芋螺多肽，发现了对神经元nAChR的α3β2亚型有特异靶向作用的Vi1.6，IC50为913.9nM(700.8~1192nM)，其对α3β4、α4β2、α7和α9α10等亚型活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率分别为（21.92±2.04）%、（10.19±2.47）%、（13.68±4.33）%、（24.22±4.66）%。4、发现α-芋螺多肽Mr1.8对nAChRα3β2亚型有选择性抑制作用，IC50为447.3nM(401.6~498.2nM)，其对α9α10也有部分抑制作用，IC50为3524nM(2383~5209nM)。但Mr1.8对α3β4、α4β2以及α7等亚型活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率分别为（33.59±3.70）%、（9.56±3.66）%和（9.46±4.58）%。5、研究了Vc1.1一系列突变体（Vc1.1[N9R]、Vc1.1[Y10V]、Vc1.1[N9R,D11N]、Benzoyl-Vc1.1[N9R]、AC-Vc1.1[N9R]、Vc1.1[N9D]）对nAChRα9α10亚型的抑制作用，结果表明Benzoyl-Vc1.1[N9R]和Vc1.1[N9D]对α9α10的抑制效果比较好，IC50分别为875.6nM(511~1500nM)和1108nM(938.7~1308nM)，但比Vc1.1（IC50=28.29nM(20.79~38.48nM)）弱。6、α-芋螺多肽Di1.1对神经元nAChRα3β4、α4β2、α7、α3β2和α9α10等亚型结合活性都很弱，浓度为10μM时，抑制率都在30%以下。结论：1、α-芋螺多肽Mr1.8，对nAChRα3β2亚型有选择性抑制作用，IC50为447.3nM(401.6~498.2nM)，其对α9α10也有部分抑制作用（数μ摩尔浓度级），但对α3β4、α4β2以及α7等亚型活性都很弱。2、Vi1.6对α3β2亚型有较好的抑制作用，IC50为913.9nM(700.8~1192nM)，其对α3β4、α4β2、α7和α9α10等亚型活性都很弱。3、Vc1.1突变体的活性顺序为：Benzoyl-Vc1.1[N9R]>Vc1.1[N9D]>AC-Vc1.1[N9R]>Vc1.1[N9R]>Vc1.1[Y10V]>Vc1.1[N9R,D11N]，Asn9在其与α9α10的结合中起关键作用，苯酰基和乙酰基能增强其活性。
【作者】丁融；
【导师】戴秋云；郑兴；
【作者基本信息】南华大学，药理学，2013，硕士
【关键词】α-芋螺多肽；神经元；nAChR；亚型；合成；靶点；

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